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呋喃它酮(AMOZ)代谢物酶联免疫试剂盒
2014-10-24  点击数:
商品名称:呋喃它酮(AMOZ)代谢物酶联免疫试剂盒
商品编号:
市场价:¥0.00
优惠价:¥0.00
计量单位:96孔/盒
  • 产品描述
  • 应用意义
  • 常用问题
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1    概述

硝基呋喃类(Nitrofurans)抗菌剂是一种广效性抗生素,因价格较低廉且疗效佳,广泛用于畜禽及水产养殖。由于硝基呋喃类抗菌剂及其代谢物对人体长期食入有致癌、致畸胎等风险,1995年起欧盟(European Union)禁止硝基呋喃类抗菌剂在食用之畜禽及水产动物使用。
本试剂盒采用直接竞争酶联免疫一步法检测呋喃它酮代谢物AOZ,经16小时的衍生及萃取步骤,ELISA检测部分不到1小时
2    原理
样品中的游离呋喃它酮代谢物与酶标记的呋喃它酮代谢物竞争结合酶标板微孔中固相化的呋喃它酮代谢物特异性抗体,通过洗涤洗掉未结合的酶标记呋喃它酮代谢物,再通过酶的专一性显色剂显色根据显色的深浅来判断样品中呋喃它酮代谢物含量。根据竞争性原理,如果样品中的游离呋喃它酮代谢物量少,则酶标记的呋喃它酮代谢物结合的多,显色深,反之,则显色浅。检测时设置标准曲线,通过标准曲线测定样品中呋喃它酮代谢物的含量。
3    试剂盒组成
3.1呋喃它酮代谢物酶标板:96孔
3.2 呋喃它酮代谢物标准品:6瓶(1ml/瓶),分别是:
标准品
浓度ng/ml
0
0.05
0.1
0.25
0.5
1.0
3.3 呋喃它酮浓缩酶结合物:1瓶(101×,100ul)
3.4衍生试剂:1瓶(12ml)
3.5 浓缩缓冲液:1瓶(10×,30ml)
3.6 浓缩萃取/清洗液: 1瓶(10×,50ml)
3.7 底物溶液:1瓶(12ml)
3.8 终止液:1瓶(13ml)
3.9 说明书:1份
4    需要而未提供的材料
4.1 酶标仪(检测波长450nm,参考波长630nm)
4.2 微量移液器
4.3 前处理所需试剂及相关仪器
5    贮存
5.1 试剂盒贮存于2-8℃,切勿冷冻
5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存
5.3 该产品有效期为12个月
6    注意事项
6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2 试剂盒使用前,将试剂恢复至室温(20-25℃)。
6.3 不要使用过期试剂盒;不同批号试剂盒中的试剂不得混用;不同标准品、样品所用吸头不能混用。
6.4 避免所有试剂接触皮肤;混合试剂时应避免起泡。
6.5 衍生试剂乃配制于DMSO中,2-8 ℃保存会有结冰现象,若提供微温(30 ℃)的水浴将有助于加速溶解。此外,为避免DMSO挥发造成操作者不适,请于抽风柜内添加此试剂。
6.6 用剩余的测试条孔则放回铝箔袋,将封口封好后储存于2~8 ℃冰箱。
7    试剂配制
7.1 缓冲液:(萃取步骤中调节pH使用)
用去离子水将浓缩缓冲液以1:9之比例稀释
例:500ml缓冲液=50 mL浓缩缓冲液+ 450 mL去离子水
注:未用完的缓冲液放置2~8 ℃贮存。使用前请确实回温后使用,并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。
7.2 萃取/清洗液:(样品萃取复溶、浓缩酶标记物稀释、清洗)
用去离子水将浓缩萃取/清洗液以1:9稀释
例:500ml萃取/清洗液=50 mL浓缩萃取/清洗液 + 450 mL去离子水
注:未用完的萃取/清洗液放置2-8 ℃贮存,使用前请确实回温后使用,并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。
7.3 酶标记物:
用萃取/清洗液将呋喃它酮浓缩酶结合物以1:100之比例稀释
例:3ml酶标记物=30ul浓缩酶标记物+ 3mL萃取/清洗液
注:酶标记物请于每次使用前新鲜配制,未使用完的请丢弃。
8    样品处理程序
8.1水产品(鱼肉、虾肉)、全蛋 (稀释倍数2):
I. 衍生反应
1. 取1 g已混匀的样本于离心管中,加入4 mL H2O,0.5 mL 1 M HCl,100μL衍生试剂。
2. 振荡混合约1分钟。
3. 置37 ℃烘箱,静置过夜(约16h)。
II. 萃取流程
1. 加入5 mL原倍浓缩缓冲液,0.4mL 1M NaOH,5mL乙酸乙酯。
2. 振荡混合约1分钟。
3. 以离心机离心10分钟(3000 rpm)。
4. 取2 mL上层液 (乙酸乙酯层)至10 ml玻璃试管。
5. 于50℃下,利用氮气将乙酸乙酯吹干。
6. 于此玻璃试管中加入1 mL正己烷,先将残余物完全溶解,再加入0.8 mL原倍萃取/清洗液。
7. 振荡混合约1分钟。
8. 以离心机离心10分钟 (3000 rpm) (若不分层则振荡混合后于沸水加热3分钟再离心一次) 。
9. 取出下层溶液(水层)50ul用于实验。
 
8.2.牛奶(稀释倍数2):
先离心10分钟(3000 rpm),除去上层脂肪,取下层液1mL置入离心管中,加入4 mL H2O 和 0.5 mL 1 M HCl及100μL 衍生试剂,其余歩骤同水产的处理方法。
 
8.3 蜂蜜(稀释倍数2):
1. 取1 mL蜂蜜样本置入离心管中,加入4 mL H2O,0.5 mL 1 M HCl,10 mL正己烷。
2. 振荡混合约1分钟,以离心机离心10分钟(3000 rpm),置-80℃冷冻30分钟(或-20℃冷冻60分钟)。
3. 移去上层液后,使用50℃水浴,将冷冻层融化。
4. 加入50μL衍生试剂,振荡混合约1分钟。
5. 置37℃烘箱,静置过夜 (约16 h) 。
6.其他步骤同水产(除萃取流程的步骤1:1M NaOH加入量改为 0.5mL)。
 
8.4.鸡肉(稀释倍数2):
检品制备步骤与水产相同唯衍生反应的步骤1,步骤改变 (详细步骤如下)
 衍生反应的步骤1:取1 g已均质鸡肉样本置入离心管中,加4 mL H2O,0.5 mL 1 M HCl,200μL 衍生试剂。其余步骤同水产。
9    酶免分析步骤
9.1实验准备
9.1.1预先进行编号,标记标准品和样品的位置,推荐进行双孔检测(每次实验都须做标准曲线)
9.1.2使用前将所有试剂回升至室温,取所需数量的微孔条,将多余板条用试剂盒提供的自封袋重新密封同时排除里面空气,并立即放回2-8℃干燥保存
 
9.2分析步骤
9.2.1在标准品孔中加入50µl各标准品溶液,在各样品孔中加入50µl样品溶液;
9.2.2在所有孔中加入50µl的稀释好的酶标记物(见配液 7.3)轻微晃动反应板使之彻底混匀,室温下(20-25℃)温浴30min;
9.2.3甩干孔中液体,用洗涤工作液(250ul/孔)洗涤微孔板4-5次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体;
9.2.4洗涤程序完成后,立即用微量移液器在每个微孔中100µl底物液,轻微晃动使之混匀;
9.2.5室温下(20-25℃)温浴20min,每孔中加入100µl终止液,混匀,在450nm下检测吸光度,结果在5min内读取。
10 结果计算
10.1 计算百分吸光度值:将每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值除以标准品0ng/ml的吸光度值再乘以100%。
10.2以呋喃它酮代谢物浓度的对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线。根据样品百分吸光度值可从曲线上得到对应点的横坐标,即为呋喃它酮代谢物浓度的对数值,求得反对数即为测定液中呋喃它酮代谢物浓度C(ng/ml)。样本经过稀释时应乘以相应稀释系数。
11 试剂盒其他参数
本试剂盒灵敏度为0.05 ng/ml
本试剂盒样本检测下限为0.1ng/ml
试剂盒板内变异系数小于8%,板间变异系数小于15%
12 分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品,应该用其他方法如GC/MS加以确认。
13 生产企业
企业名称:上海快灵生物科技有限公司
地址:上海市浦东新区杨高南路1998号    邮政编码:200125
电话:021-50947188    
传真:021-50947186
信箱:info@quicking.cn

呋喃它酮代谢物根据农业部的标准,不应在动物性食品中被检出。

 

常见问题及解答
问题一、加入反应终止液后,没有吸光值或吸光值偏低

可能原因
解决办法
未加入酶结合物
按照操作步骤重复实验
试剂盒未能充分回温
将试剂盒放在室温下(20-25℃) 回温后再进行操作(最少一个小时)
试剂盒已过有效期
请使用在有效期内
实验室室温太低(低于20 ℃ )
请提高反应温度至(20-25℃) ,若无法提高,请适当延长第一步温育反应时间 ,可将30min延长至40min)
未使用试剂盒中酶结合物、洗涤液等
请使用试剂盒中提供的物品进行实验,不同批号的试剂盒不能混用
终止试验后太久未判读
请在加入终止液后5min内判读
使用过的试剂盒未保存好
实验后未用完的试剂要放回2-8 ℃保存,未用完的酶标板要放到试剂盒提供的自封袋中与干燥剂一起密封保存在2-8 ℃
洗液配制错误
请使用试剂盒提供的洗液

 
问题二、标准曲线线性不佳,与试剂盒中质检报告的曲线不一致,或者重复性差

可能原因
解决方法
温育位置未避光或收到气流干扰
温育时不要直接暴露在强光下(日光等没有关系),也不要受到气流的干扰(如可在不通风的实验室)
操作时间拖太久
实验操作熟练后再进行实验,一旦开始实验就不要在中途离开
板孔间相互污染
加样时,要小心切勿溅出孔外,造成其他板孔的污染
加样量不准
移液器请校准,保持加样的准确性
加样时的操作放大不正确
 
洗涤过程不正确
洗涤时确保每个微孔加样量一致;每次洗涤时间不要太长(导致过度洗板),也不要太短(洗板不彻底),一般10s左右;洗涤步骤完成后立即进行下一步骤

 
问题三、背景值或吸光度(OD)过高

可能原因
解决方法
室温太高(大于25 ℃ )
保持实验室温度20-25℃,避免在热源或阳光直射处实验
底物溶液受到污染
若发现底物溶液已经变色,不要再使用
反应时间太长
请严格控制实验反应时间
酶结合物污染了试剂盒中其他试剂
使用过的吸头立即丢弃,每次吸取不同的试剂要更换新的吸头,凡是试剂(特别是酶结合物和底物)接触过的容器立即清洗干净
使用了质量差的水
尝试用蒸馏水配制溶液

 
问题四、一个或多个标准品数据点超出曲线范围

可能原因
解决方法
洗涤过程不正确
洗涤时确保每个微孔加样量一致;每次洗涤时间不要太长(导致过度洗板),也不要太短(洗板不彻底),一般10s左右;洗涤步骤完成后立即进行下一步骤
微孔中的试剂未充分混匀
试剂加完后,在振荡器上振荡混匀(没有振荡器可轻敲板四周或在桌面上做圆周运动使其充分混匀)
阴性标准品受到污染
严格按照试剂盒的操作说明进行实验
加入标准品和试剂的时间不一致
确保一切就绪,由低浓度到高浓度快速添加标准品并保证不被打扰
标准品添加顺序混乱或放置错误位置
按照说明要求重复试验并保证由低到高的顺序依次添加
标准品被污染或与其他标准品混淆
改用新标准品
标准品加样量不准
确保加样的准确性

  
问题五、板内及板间差异大

可能原因
解决方法
加入标准品和试剂、样品的时间不一致
尽可能排枪,中间不要间断
排枪使用不当
校准排枪检测吸嘴是否套紧,确保吸液量一致
洗涤系统出现故障
检测洗涤系统
不同批次的试剂混用
确保每个试剂盒不混用
板与板之间孵育时间差距过大
独立计时,确保一致的孵育时间

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