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氯霉素(CAP)酶联免疫检测试剂盒
2014-10-27  点击数:
商品名称:氯霉素(CAP)酶联免疫检测试剂盒
商品编号:
市场价:¥0.00
优惠价:¥0.00
计量单位:96孔/盒
  • 产品描述
  • 应用意义
  • 常用问题
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1    概述

氯霉素是一种常用的广谱抗菌素,通过抑制细菌蛋白质合成而发挥抑菌作用,对大多数革兰氏阴性和阳性细菌有效,而对革兰氏阴性菌作用较强,特别是对伤寒、副伤寒杆菌作用最强。但使用氯霉素存在严重的毒副作用,主要是抑制骨髓造血功能,引起粒细胞及血小板减少症以及再生障碍性贫血。再生障碍性贫血虽少见,但难逆转,常可致死。
本试剂盒采用竞争酶联免疫法,测定肉类、水产品、牛奶、蛋类、蜂蜜、蜂皇浆、饲料等食品中的氯霉素类药物残留。
2    原理
样品中的游离氯霉素与酶标记的氯霉素竞争结合酶标板微孔中固相化的氯霉素特异性抗体,通过洗涤洗掉未结合的酶标记氯霉素,再通过酶的专一性显色剂显色根据显色的深浅来判断样品中氯霉素含量。根据竞争性原理,如果样品中的游离氯霉素量少,则酶标记的氯霉素结合的多,显色深,反之,则显色浅。检测时设置标准曲线,通过标准曲线测定样品中氯霉素的含量。
3    试剂盒组成
3.1氯霉素酶标板:96孔
3.2 氯霉素标准品:6瓶(1ml/瓶),分别是:
标准品
浓度ng/ml
0
0.025
0.1
0.2
0.4
1.6
3.3 氯霉素酶结合物:1瓶(6ml)
3.4 浓缩样品复溶液:1瓶(10×, 25ml)
3.5 浓缩洗涤液:1瓶(10×,50ml)
3.6 底物液A:1瓶(6ml)
3.7 底物液B:1瓶(6ml)
3.8 终止液:1瓶(6ml)
3.9 说明书:1份
3.10 质检报告:1份
4    需要而未提供的材料
4.1 酶标仪(检测波长450nm,参考波长630nm)
4.2 微量移液器
4.3 前处理所需试剂及相关仪器
5    贮存
5.1 试剂盒贮存于2-8℃,切勿冷冻
5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存
5.3 该产品有效期为12个月
6    注意事项
6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2 试剂盒使用前,将试剂恢复至室温(20-25℃)。
6.3 不要使用过期试剂盒;不同批号试剂盒中的试剂不得混
用;不同标准品、样品所用吸头不能混用。
6.4 避免所有试剂接触皮肤;混合试剂时应避免起泡。
7    试剂配制
7.1 洗涤工作液:
用去离子水将浓缩洗涤液按1:9体积进行稀释
例如:10ml洗涤工作液=1ml浓缩洗涤液+9ml去离子水
7.2 样品复溶液:
用去离子水将浓缩样品复溶液按1:9体积进行稀释
例如:10ml样品复溶液=1ml浓缩样品复溶液+9ml去离子水
8    样品处理程序
8.1牛奶、蜂蜜、蜂皇浆、饲料
取2g样本于玻璃管中,加入3ml去离子水(蜂皇浆加0.5M氢氧化钠),摇匀,再加入8ml乙酸乙酯充分振摇混合10min, 4000g离心10min。取2ml上层液移入另一玻璃管,并用50℃氮气流吹干。于试管残留物中加入0.5ml样品复溶液(见配液7.2)充分摇匀(饲料需再加入0.5ml正己烷震荡混匀后取下层),取50ul用于检测。(稀释系数1)
8.2 肉类、水产(虾、鱼)、蛋类
取2g已去除脂肪的肉类、水产(虾、鱼)、蛋类并匀浆化的样品于玻璃管中,加入8ml乙酸乙酯充分振摇混合10min, 4000g离心10min。取2ml上层液移入另一玻璃管,并用50℃氮气流吹干。于试管残留物中加入0.5ml样品复溶液(见配液7.2),并加入0.5ml正己烷,充分摇匀,4000g离心10min。离心后,若下层液出现乳化现象,应将试管放入80℃水浴中5min,再进行离心。完全除去上层的正己烷,从试管底部吸取50ul下层液用于检测。(稀释系数1)
8.3 血清(鸡血清、牛血清等)
方法一:用样本复溶液5倍稀释。例如:200ul血清+800ul样本复溶液(稀释倍数5)
方法二:准确移取1ml血清,加入4ml乙酸乙酯,振荡混匀,静置2min,取2ml上层液移入另一玻璃管,并用50℃氮气流吹干。于试管残留物中加入0.5ml样品复溶液(见配液7.2),并加入0.5ml正己烷,充分混匀。吸取液体到1.5ml离心管中,去掉上层有机层,取下层澄清液体50ul用于检测。(稀释倍数1)
9    酶免分析步骤
9.1实验准备
9.1.1预先进行编号,标记标准品和样品的位置,推荐进行双孔检测(每次实验都须做标准曲线)
9.1.2使用前将所有试剂回升至室温,取所需数量的微孔条,将多余板条用试剂盒提供的自封袋重新密封同时排除里面空气,并立即放回2-8℃干燥保存
9.2分析步骤
9.2.1在标准品孔中加入50µl各标准品溶液,在各样品孔中加入50µl样品溶液;
9.2.2在所有孔中加入50µl的氯霉素酶标记物溶液,轻微晃动反应板使之彻底混匀,室温下(20-25℃)温浴30min;
9.2.3甩干孔中液体,用洗涤工作液(250ul/孔)洗涤微孔板4-5次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体;
9.2.4洗涤程序完成后,立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl底物液A,再加 50µl底物液B,轻微晃动使之混匀;
9.2.5室温下(20-25℃)温浴15min,每孔中加入50µl终止液,混匀,在450nm下检测吸光度,结果在5min内读取。
10 结果计算
推荐使用快灵Log/Logit计算程序对检测结果进行计算,将检测OD均值和标准品浓度输入,即可自动获得检测结果,再乘以稀释倍数1,即为样品氯霉素浓度
11 特异性
氯霉素……100% 氯霉素碱……0.5% 甲基氯霉素……<0.1%
12 试剂盒其他参数
本试剂盒检测下限为0.025ng/ml
B0吸光度最佳值应大于0.8
牛奶、蜂蜜、蜂皇浆、饲料回收率85±15%
肉类、水产(虾、鱼)、蛋类回收率85±15%
血清回收率100±10%
试剂盒吸光度板内误差小于8%,板间误差小于15%。
13 分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品,建议用其他方法如HPLC加以确认。

根据农业部的标准,氯霉素不应在动物性食品中被检出。

 

常见问题及解答
问题一、加入反应终止液后,没有吸光值或吸光值偏低

可能原因
解决办法
未加入酶结合物
按照操作步骤重复实验
试剂盒未能充分回温
将试剂盒放在室温下(20-25℃) 回温后再进行操作(最少一个小时)
试剂盒已过有效期
请使用在有效期内
实验室室温太低(低于20 ℃ )
请提高反应温度至(20-25℃) ,若无法提高,请适当延长第一步温育反应时间 ,可将30min延长至40min)
未使用试剂盒中酶结合物、洗涤液等
请使用试剂盒中提供的物品进行实验,不同批号的试剂盒不能混用
终止试验后太久未判读
请在加入终止液后5min内判读
使用过的试剂盒未保存好
实验后未用完的试剂要放回2-8 ℃保存,未用完的酶标板要放到试剂盒提供的自封袋中与干燥剂一起密封保存在2-8 ℃
洗液配制错误
请使用试剂盒提供的洗液

 
问题二、标准曲线线性不佳,与试剂盒中质检报告的曲线不一致,或者重复性差

可能原因
解决方法
温育位置未避光或收到气流干扰
温育时不要直接暴露在强光下(日光等没有关系),也不要受到气流的干扰(如可在不通风的实验室)
操作时间拖太久
实验操作熟练后再进行实验,一旦开始实验就不要在中途离开
板孔间相互污染
加样时,要小心切勿溅出孔外,造成其他板孔的污染
加样量不准
移液器请校准,保持加样的准确性
加样时的操作放大不正确
 
洗涤过程不正确
洗涤时确保每个微孔加样量一致;每次洗涤时间不要太长(导致过度洗板),也不要太短(洗板不彻底),一般10s左右;洗涤步骤完成后立即进行下一步骤

 
问题三、背景值或吸光度(OD)过高

可能原因
解决方法
室温太高(大于25 ℃ )
保持实验室温度20-25℃,避免在热源或阳光直射处实验
底物溶液受到污染
若发现底物溶液已经变色,不要再使用
反应时间太长
请严格控制实验反应时间
酶结合物污染了试剂盒中其他试剂
使用过的吸头立即丢弃,每次吸取不同的试剂要更换新的吸头,凡是试剂(特别是酶结合物和底物)接触过的容器立即清洗干净
使用了质量差的水
尝试用蒸馏水配制溶液

 
问题四、一个或多个标准品数据点超出曲线范围

可能原因
解决方法
洗涤过程不正确
洗涤时确保每个微孔加样量一致;每次洗涤时间不要太长(导致过度洗板),也不要太短(洗板不彻底),一般10s左右;洗涤步骤完成后立即进行下一步骤
微孔中的试剂未充分混匀
试剂加完后,在振荡器上振荡混匀(没有振荡器可轻敲板四周或在桌面上做圆周运动使其充分混匀)
阴性标准品受到污染
严格按照试剂盒的操作说明进行实验
加入标准品和试剂的时间不一致
确保一切就绪,由低浓度到高浓度快速添加标准品并保证不被打扰
标准品添加顺序混乱或放置错误位置
按照说明要求重复试验并保证由低到高的顺序依次添加
标准品被污染或与其他标准品混淆
改用新标准品
标准品加样量不准
确保加样的准确性

  
问题五、板内及板间差异大

可能原因
解决方法
加入标准品和试剂、样品的时间不一致
尽可能排枪,中间不要间断
排枪使用不当
校准排枪检测吸嘴是否套紧,确保吸液量一致
洗涤系统出现故障
检测洗涤系统
不同批次的试剂混用
确保每个试剂盒不混用
板与板之间孵育时间差距过大
独立计时,确保一致的孵育时间

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