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免疫胶体金层析技术在兽医临床上的应用
2011-10-12  点击数:
       摘 要:胶体金免疫层析技术(Gold immuno-chromatographic assay,GICA)是20世纪80年代发展起来的一项固相标记免疫检测技术,有机地将胶体金标记技术、层析分析技术和免疫检测技术等多种方法结合起来,应用该技术制成的胶体金试纸条具有简便、快速、灵敏、特异性高等优点。文章介绍了胶体金技术的基本原理、胶体金技术的特点以及利用该技术制成的胶体金试纸条在兽医临床上的应用。
 
关键词:单克隆抗体;胶体金免疫层析;快速检测
 
       免疫胶体金技术在人类医学上是一种常用的免疫标记技术,在医学检验中的应用主要是胶体金快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法,用于检测人类乙肝表面抗原、人绒毛膜促性腺激素、滋病病毒等。近年来,随着该技术的不断发展、完善及养殖业对疾病检测要求的不断提高,上海快灵生物有限公司充分利用国内、外快速诊断的最新研究成果,相继开发了不同系列(病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫病的诊断及兽药残留的检测)胶体金快速诊断试纸,目前已在兽医临床上得到了广泛应用,具有简便、快速、灵敏、特异性高和无污染等优点。
 
1、 胶体金免疫层析技术的研究进展
1.1     基本原理 胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体反应的一种新型的免疫标记技术。胶体金是氯金酸在还原剂如柠檬酸盐、鞣酸-柠檬酸盐等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷,胶体金颗粒具有双层电结构,中心为许多金原子组成的胶金核,其外为AuO2-及部分反粒子所形成的吸附层。胶金核+吸附层叫胶金粒,胶金粒与扩散层共称为胶团,其结构见下。蛋白质分子带正电荷,胶体金带负电荷,二者极易静电结合形成大的聚合物,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性,从而可以做为示踪标记物应用于生物行业各领域中。
 
      免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性,在显微镜下金标蛋白结合处,可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而可用于定性或半定量的快速免疫检测。
 
1.2    免疫胶体金快速诊断技术的优点
1.2.1 特异性:胶体金大多用于单克隆抗体标记,对组织细胞的非特异性吸附作用小,具有较高的特异性;
1.2.2 灵敏性:用GICA试纸条检测中国药品生物制品检定所的乙肝表面抗原标准品,灵敏度可达1ng/ml;
1.2.3 快速性:检测一般仅需5~10 min,相比其它方法(ELISA、PCR等)大大缩短检测时间;
1.2.4 简便性:样品处理简单或不需要做前处理(如组织液、血清、粪便和尿液等),检测结果用颜色显示,肉眼判断容易,不需特别仪器;
1.2.5 稳定性:因胶体金标记蛋白质是一物理结合过程,试剂稳定,不受外界因素影响,因而可在医院、办公场所甚至野外进行各种疾病的检测,检测结果可长期保存。
 
1.3免疫胶体金快速诊断技术的发展方向
1.3.1 提高检测灵敏度:GICA的灵敏度与ELISA基本相近,部分GICA的敏感度可达到1 ng/mL或更低水平,但是有些达不到如此的敏感度,灵敏度的提高拓宽了GICA的检测范围。提高灵敏度的关键是对捕获信号进行放大、采用新的标记物或引入生物素一亲和素系统,可明显提高灵敏度和稳定性。
1.3.2 实现多项联检:在同一膜上固定多种反应物,可采用多膜复合或单膜多元受体固定两种方式,这对于检测某些具有联检意义的项目具有很大的应用价值。如食品(牛奶、原料)抗生素霉菌毒素残留的检测组合对抗生素、霉菌毒素残留筛选会更为方便。
1.3.3 实现定量检测:GICA测定时,大部分是定性和半定量的,只适用于检测临床样本中是否含有超过检测浓度的特定生物成分存在。很多其它检测需要定量,GICA定量检测可以分为3种类型:
① 通过试纸条的颜色深浅的视觉比较,这种检测只能提供半定量结果,结果可分为阴性、弱阳性和强阳性;
② 检测线的反应剂设计成只能结合已知一定量的分析物,任何过量的分析物将会和下一条检测线结合,产生一个温度计式的条带梯度,显示分析物的浓度范围(如尿中人血清白蛋白),进行半定量化检测;
③应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度,将颜色强度转化为数字指标,以实现定量的检测。
 
2、免疫胶体金技术在兽医学中的应用
2.1 免疫胶体金技术在宠物传染病诊断中的应用
       随着中国宠物饲养的数量、品种逐年递增,随之而来宠物病毒性传染病的发病率也呈现上升趋势,除传统的犬瘟犬细小病毒、猫瘟的发生外,其他如犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅱ型、猫传染性腹膜炎等病毒病也给宠物的健康带来了巨大威胁。
       上海快灵生物科技有限公司开发了犬、猫不同系列胶体金快速诊断试纸及鉴别诊断试纸。其中对收集到的120份犬粪便样品进行犬细小病毒检测,其结果与血凝试验结果相比较,血凝效价在1:40以上,试纸条均能检测为阳性,该试纸条与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应,且试纸条保存6个月后,其检测结果重复性为100%。
 
2.2 免疫胶体金技术在畜禽疾病诊断中的应用
       随着世界范围内畜禽业的养殖规模不断扩大,动物传染病对养殖的危害也随之加剧。对畜禽疾病进行快速有效防治的关键是快速、准确地对其致病的病原进行有效确诊。减少畜禽传染病的发生和流行,除加强场舍的隔离消毒,减少自然环境中的病毒,还必须制定合理的免疫程序,及时监测畜禽体内的有效抗体水平,同时对发病畜禽进行病原的快速确诊工作,对出现传染病的区域流行的特点,给合临床诊断和防治作好防治工作。
 
      李学伍等以琼扩为对照,应用传染性法氏囊病(IBD)试纸条分别检测了人工感染鸡、疫苗接种鸡和自然发病鸡三种不同类型的法氏囊样品以及不同的疫苗,检测结果证明,IBD试纸条具有特异、敏感和快速的特点,其敏感性高于琼扩,为IBD诊断提供了新方法。高玲美等研制出了快速检测NDV的免疫层析试纸条。吴华莉等利用AIV H5亚型单抗制备了H5亚型AIV诊断试纸,该试纸条和血凝试验结果一致。
      陈龙宾等应用猪瘟抗原试纸条对猪瘟可疑病料进行检测,同时用直接荧光抗体试验和RT-PCR 做平行试验。结果显示,用试纸条检测猪瘟病毒,10 min 左右即可显示结果,试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT2PCR 的阳性检出率依次为36.36 %(4/ 11) 、45. 45 %(5/ 11) 和72. 72 %(8/ 11) 。用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便,需时短,可以用于猪瘟的流行病学调查。
        上海快灵生物科技有限公司对畜禽抗原、抗体分别成功研发出系列产品,为基层兽医站和各养殖场开展疫病的监测及区域性疫病普查起了非常重要的意义,对传染病的防治提供了快速的切断传染源的途径。
 
2.3 免疫胶体金技术在食品安全诊断中的应用
        小分子检测还有农药检测、重金属检测等目前亦有胶体金快检产品出现,如用于检测食品中的盐酸克伦特罗、氯霉素、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺二甲基嘧啶、有机磷农药等残留物质的快速检测试剂盒。
      李余动等采用竞争法研制了金标试纸条,将胶体金标记氯霉素单抗,并将人工合成的氯霉素包被于检测线,其与待测样品中氯霉素竞争结合金标氯霉素单抗。检测虾肉等组织样品时,最低检出量可达到1ng/ml。刘见等选取自身蛋白合成盐酸伦特罗克伦特罗-载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的金标试纸条。试纸条对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng/ml,检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。
 
3 展望
      目前,兽医临床上许多病的检测方法仍较多地局限于传统的血清学方法,难以适应病原快速诊断的发展要求。近年来,免疫胶体金技术以其简便快速,特异性强、敏感性高,肉眼判读,实验结果易保存,无需特殊仪器设备和试剂等优点,被广泛应用在于兽医临床疾病诊断和检验检疫中。随着胶体金新的标记物和制备方法的发展,免疫胶体金技术将会有更为广阔的应用前景。

 

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