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养殖场病原诊断新技术——基因试纸卡
2014-10-22  点击数:
畜禽养殖场作为动物疫病传播的源头,在疫病发生时及时进行病原诊断,采取相应的应对措施,是目前动物疫病防控的关键环节。
目前国内动物疫病的病原学诊断试剂选择范围有限。而在通用的血清学检测试剂中,绝大多数是检测血清中抗体的免疫试剂,其结果更多反应了疫苗免疫效果,对病原感染只能间接分析,无法确诊,何况动物在遭受感染后,病毒要在体内潜伏一段时间,动物才会产生抗体,检测结果往往滞后病原感染。能对野毒感染进行鉴别的成熟抗体检测试剂只有猪伪狂犬的gE抗体试剂盒,由于疫苗的纯化工艺问题,口蹄疫的非结构蛋白的抗体目前无法产生理论上的鉴别诊断作用。另一方面能监测疫病病原的试剂的商品化试剂偏少。免疫荧光抗体技术受限于基层养殖场荧光显微镜以及荧光标记抗体的缺乏,故在多数基层养殖试验室难以普及。由于达到市场需求的特异性及灵敏度并能配对的动物疫病抗体的缺乏,免疫试剂中目前的病原检测产品很少,这类产品开发的周期长,不确定性很大,很难应对基层疫病防控的需要。因此养殖场试验室亟需合适的病原学检测试剂。
鉴于基于核酸扩增的分子诊断技术发展迅速,荧光PCR及电泳PCR已经被农业部及各省市疫控单位逐步采用,扭转了疫病诊断中病原诊断技术空白的态势。但对养殖场基层试验室来说,PCR分子诊断技术的使用存在不少阻碍:1、分子诊断试剂一般要冷冻保存,成本高且运输半径有限;2、核酸提取步骤复杂缓慢,基层技术人员操作困难;3、基层单位无力购买价格偏高的PCR扩增仪,基层技术人员也不容易掌握仪器操作要领。因为这些难点的存在,分子诊断技术一直没有在我国养殖基层试验室普及。
快灵生物开发的基因试纸卡,开启了现场分子诊断步入养殖场的新时代。它包括基因提取试剂、恒温扩增试剂及免疫层析试纸卡三部分,能常温运输;在常温下同时完成 DNA/RNA样品提取,仅需微型离心机或专利磁力架10分钟内完成操作;添加样品模板后将反应管密闭后放置在变温金属浴上保温60分钟,扩增完成后将反应管插入试纸卡槽后一步按压就启动溶液层析,3-5分钟后即可目视层析试纸的线条显色判定结果。专利申请中的基因试纸卡解决了扩增产物溶液及其气溶胶的泄漏污染导致后续样品交叉污染的问题,开启了现场分子诊断步入了基层养殖场的新时代。基因试纸卡能直接检测到病原,很适合对健康携毒排毒的动物进行筛查,也适合对感染早期的动物进行确诊,大大缩短窗口期。此外,对于罕见病原或突然爆发的新病原,只要能在基因库中查询到该病原的基因序列,基因试纸卡能最快在一周内研发出来。该基因试纸卡的操作过程以专利磁力架,变温金属浴,两支移液枪为例说明如下图。
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快灵生物的基因试纸卡检测盒的特点在于:
1.简单快速提取核酸:快灵生物的核酸提取试剂在常温下10分钟内能同时完成样品中DNA与RNA的提取。目前基因变异最快,危害性最大的疫病往往都是RNA病毒引起的。其他商业化RNA病毒提取试剂一般要求在低温冷冻条件下提取操作,基层单位往往无法实现。快灵生物经过无数次的实验摸索,终于配制了独特的基因提取试剂,仅需微型高速离心机或专利磁力架,10分钟内就能完成单份样品的核酸提取。我们已经在细菌病毒样品,全血与组织样品分别进行了DNA、RNA的提取实验,结果都很良好。简单的RNA提取试剂是基因试纸卡步入基层应用的基础。
2. 扩增核酸的高灵敏高特异的快速免疫检测技术:快灵生物通过胶体金试纸实现了基因扩增产物的高灵敏高特异检测。胶体金试纸具有极高的的检测灵敏度,如克伦特罗的产品能达到纳克级别(单位ng/ml),而基因扩增技术则可以迅速将超痕量的靶基因特异扩增百万倍。快灵生物将胶体金技术与基因扩增技术完美结合,实现了高灵敏的核酸检测。我公司对照试验表明,当PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上呈现微弱信号时,快灵生物的基因试纸卡对稀释100倍的扩增产物仍有明显信号。当LAMP恒温扩增溶液采用染料(如SYBR Green I)只能检测到微弱信号时,快灵生物基因试纸卡对100倍稀释后的扩增溶液仍有明显信号。因此基因试纸卡能实现更高灵敏度的信号检测,或者在同样的产物浓度下,能保证更好的信号判别。更重要的是染料检测方法没有特异性,只要溶液中存在一定浓度的核酸就有信号,无法区分信号是来自特异性扩增产物还是非特异性扩增产物。而基因试纸卡的检测则是引物与探针双重保证扩增产物的特异性,能很好地区分非特异扩增产物。
3. 精致的防污染基因试纸卡:快灵生物专利申请中的防污染基因试纸卡,是目前解决基层单位基因扩增产物污染的最佳方案。尽管在荧光定量PCR和LAMP等方法中,可以不开盖检测,但其使用的反应管并没有严格密封的结构设计,渗漏与意外开盖仍然可能导致污染。快灵生物专利申请中的防污染基因试纸卡的塑料套件中存在多级密封设计,并能承受一定的空气压力差,反应管内的扩增产物被封存在试纸卡中,即使层析试纸上的扩增产物形成了气溶胶也无法扩散出来。
4. 一步操作的核酸恒温扩增技术:快灵生物采用了一步操作的核酸恒温扩增技术,适合基层单位操作人员使用。近年开发出了多种恒温扩增技术,有些技术需要进行多步操作才实现核酸(DNA或RNA)的扩增。快灵生物公司综合了LAMP技术与RCA技术的特点,独创了新型的恒温扩增技术,能一次添加相关试剂与样品后,在50℃/64℃两个温度下共反应60分钟就能达到层析试纸需要的信号浓度。
5. 基因试纸卡的常温运输:快灵生物的基因试纸卡检测盒中的试剂与物料都能在常温下运输,解决了基因检测试剂对基层单位的物流障碍。目前绝大部分的基因检测试剂都需要在-20℃的条件下采用干冰运输,使得产品的配送和使用极为不便。作为农牧业的基层单位,出于疫病防控的需要,畜禽养殖场往往地处郊区或偏远的乡村。基因检测试剂的常温运输,是基因检测技术进入这些基层单位的先决条件。快灵产品则采用独有的保护剂,对检测试剂中不易保存的成分进行冻干固化,完全实现了产品的常温运输,给广大养殖场开启了基因检测技术的大门。
6. 最适应基层人员使用的方案:快灵生物的基因试纸卡检测盒的全流程操作简单方便,即使中学文化人员经简单培训就能掌握。因此对广大的基层单位客户,采用基因试纸卡进行疫病检测,完全不需要额外招聘专业的技术人员。同时基因试纸卡所需配套仪器只有微型高速离心机或专利磁力架,变温金属浴和两支移液枪,需要的配置费用较低,绝大部分的基层单位都能负担得起。

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