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食源性致病菌样品检测处理技术研究进展
2013-05-03  点击数:

        随着经济全球化进程的加快,食品安全已成为当今世界性公共卫生热点,而食源性致病菌是食源性疾病中最常见的生物致病因素,感染后可引起细菌性食物中毒和多种感染性腹泻。随着科学技术的发展,针对致病菌的检测技术多种多样,灵敏度、特异性及检测速度都得到了极大改善。但基于核酸扩增的技术很难避免样本中存在的死亡菌体对检测结果的影响而造成的假阳性结果;很多传统增菌培养方法低估了由温度、盐类、干燥、辐射、重金属、抗生素、高压等多种因素造成的微生物受损,这些受损微生物在合适的条件下可以恢复到正常状况,是影响食品安全的一种潜在威胁。另外,目前的热点技术,如基因芯片技术、生物传感器技术等虽然使用方便,但依旧很难避免样品处理过程对检测的影响。本文将对食源性致病菌相关样品前处理技术的研究进展进行综述,以便开发出快速灵敏、使用方便、价格低廉的检测技术。

        1.膜浓缩技术

        利用膜浓缩技术或免疫磁珠等浓缩技术选择性去除样本基质中影响致病菌检测的物质,同时浓缩样本中致病菌的浓度,从而达到间接增高检测灵敏度的目的。Chen,W.T.等2005年利用膜过滤技术研究了膜结构、孔尺寸及吐温20等对单增李斯特菌的分离浓缩效果。回收过程中添加吐温20可以防止菌被膜不可逆吸附以保证高回收率,另外通过比较聚碳酸酯、混合纤维素、尼龙及PVDF等不同材质的膜及0.2~0.45μm大小不同的滤膜孔径,发现0.2μm的聚碳酸酯,单向直孔可获得较高的回收率。该课题组利用注射过滤器可将50mL食品样本浓缩至500μL,菌的回收率为95%,这种方法比较适合于液体量较大的样品中病菌的浓缩。Fitzmaurice,J等结合多重PCR检测比较了膜技术和免疫磁珠分离技术对大肠杆菌在牛肉中的回收效果。研究表明37℃下,增菌时间>16h时,菌量高于log(10)9.6~7.5cfu/mL时,膜分离和免疫磁珠分离均可回收到相同程度的菌,利用PCR技术都可检测到。若大肠杆菌量降至log(10)6.4cfu/mL,只有免疫磁珠分离的菌量可以用PCR检测到,低于这个水平后,两种菌分离方法分离的菌都不能通过PCR检测到。

        2.离心浓缩技术

        K.A.Stevens等采用离心分离牛奶中的单增李斯特菌和肠道沙门氏菌,结合PCR进行检测。Fukushima,H.等利用浮力密度梯度离心(Buoyant density gradient centrifugation)从复杂的食品基质中分离细菌,除去一些不利于快速检测方法反应如PCR反应的物质,避免死细胞中来源DNA带来的假阳性结果。结合过滤,低速、高速离心,浮选和浮力密度梯度离心,在13种不同类的食品中12种致病菌可以被快速分离(沙门氏菌、大肠杆菌、结肠炎耶耳森菌、空肠弯曲杆菌、霍乱弧菌O139、副溶血弧菌、创伤弧菌、产碱普罗威登斯菌、嗜水气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌)。这种方法可以结合实时荧光定量PCR和活细胞计数进行检测。这些技术相结合,理论上,食品中的这些目标微生物可被浓缩至250倍,检测限可低至101~103CFU/g。分离、浓缩技术和实时荧光定量PCR相结合在3h内就可检测出101~102CFU/g自然感染的鸡肉中的沙门氏菌和空肠弯曲杆菌,以及食源性中毒食物中的金黄色葡萄球菌,结果表明使用这些方法是可行的。

        3.直接吸附浓缩技术

        沸石可以在表面吸收微生物,并且对某种沸石可以选择性的吸收特异的微生物。Kubota,M.等使用不同的微生物细胞系测试了在不同的pH值下沸石的吸收能力。发现某些微生物细胞系的吸收取决于pH,还有些微生物喜欢酸性pH。电位势Z(Zeta-potentials)被用于计算沸石和微生物细胞之间的双电荷层互作用能。发现在互作用能和实验吸附结果之间存在关系。他们还使用微生物吸附碳氢化合物法(MATH)评价了细菌细胞表面的疏水性并进行了相对定量,结果发现了吸附结果、细菌细胞的疏水作用和沸石之间存在一定的关系。这些结果表明沸石对细菌的吸附主要可以用双电荷层相互作用和疏水相互作用来解释。最后,利用沸石Na-BEA和H-Y,成功地分离了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌,表明沸石可以很有效地被用于快速、方便、准确地分离细胞。Kun Yang等研究发现平均500nm的超顺磁阴离子交换材料磁珠(SiMAG beads)可用于吸附浓缩非常稀释的液体中的病原菌。实验证明当溶液/磁珠的体积比为1000时,可从104CFU/mL显著减低检测限至102CFU/mL。

        4.免疫磁分离技术

        免疫磁分离技术(immunomagnetic separation)是利用一种表面包被有针对目标菌的特异性抗体的超顺磁材料从样本中复杂的基质中选择性分离目标菌的分离技术。Xiao-Li Su等用量子点(QDs)作为荧光标记在免疫磁珠上用于选择性分离大肠杆菌O157:H7,分离后再将磁珠与结合有生物素的大肠杆菌O157:H7,抗体结合形成夹心复合物,将复合物用荧光测量装置进行检测,最终检测限可低至103CFU/mL。Zheng-You Yang等用免疫磁珠分离技术分离肉中的产气荚膜杆菌,结合PCR扩增可在10h内检测肉中最低10CFU/g的产气荚膜杆菌,同传统的培养方法进行比对后,结果一致。Samuel Duodu等结合过滤技术可在3.5h内快速检测鲑鱼中的单增李斯特菌,Le Ly Thuy Tram等在3h内利用IMS-PCR技术可最低检测鸡肉中10CFU/μL的空肠弯曲杆菌。

        5. 增菌培养基的改良

        目前,针对培养基的研究主要表现在比较不同培养基的增菌效果,从而达到用于减少增菌时间的目的,一般不同的致病菌需要的培养基会不同。Zhao,T.等研究讨论了一种普遍适用的培养基(UPB)恢复受损伤的病菌或增菌,以便于在尽量短的时间下更有效的进入检验阶段,比较了不同增菌时间下对后续免疫学快速检测或PCR快速检测等快速检测方法的影响,研究发现在UPB培养基中,对于免疫检测或PCR检测,增菌6h不足于达到能检测的菌量,受损细菌一般在生长之前需要3~4h的恢复。

        6. 展望

        各种致病菌检测的前处理技术各有所长,也有各自的缺陷,很难指望一种技术解决所用问题。为了提高灵敏度和特异性,缩短检测时间,研究人员通常要把一些技术结合起来,扬长补短,比如可通过优化增菌培养基成分缩短增菌时间后,结合离心、超滤等浓缩纯化技术去除影响后续检测反应的物质,浓缩靶标菌来达到快速、灵敏、特异的检测目的。将快速有效的前处理技术开发成功后,目前基于不同检测原理的致病菌检测技术将得到更加广泛和有效的应用,如Grant,I R等将IMS和PCR技术相结合开发出免疫磁分离PCR快速检测技术,(IMS-PCR)检测牛奶样品中的分支杆菌和类结核菌,并利用离心技术将牛奶样品从10mL或50mL浓缩至1mL,然后进行免疫磁珠分离,大大提高了检测灵敏度和特异性。

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