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基因试纸卡--开启基因检测步入基层养殖场的新时代
2013-06-03  点击数:

开启基因试纸卡步入畜禽养殖场的新时代

上海快灵生物2006年成立于上海市浦东新区。公司致力于为农牧业研发生产快速诊断试剂。现有产品涵盖宠物、畜禽、食品安全和人类医学等多个市场,经过多年潜心研发,上海快灵生物隆重推出防污染基因试纸卡检测盒。基因试纸卡能检测任何携带DNA/RNA遗传信息的物种,如转基因作物,食源性致病菌,种源基因(如掺假牛羊肉),生物遗传缺陷或功能基因,胚胎性别基因,当然在农牧业更主要的是对传染性疫病进行基因检测。

有了这类产品,畜牧业的疫病专家在养殖场基层实验室能直接进行疫病病原的基因检测。如现场能快速确诊临床病例,对外购的商品畜禽或种畜种禽进行重点疫病的排查检疫,对执行了疫病净化计划的畜禽养殖场做病原的基因筛查。基因试纸卡的灵敏度比胶体金免疫试纸病原检测卡超过近一万倍,达到甚至超过了在国家诸多重点实验室使用的荧光定量PCR方法。快灵生物研发的基因试纸卡产品针对基层单位的使用条件和需求进行了细致研发,能弥补传统的病理解剖分析和免疫学诊断的不准确性,同时较现有病原检测方法极大地缩短了检测窗口期,更早更快地实现疫病的防控。

除了疫病的病原确诊,畜牧养殖业更需要的是养殖过程中疫苗免疫效果的监测。因此快灵生物公司组建了完整的基因工程蛋白制备和免疫学诊断试剂的研发团队和体系,已经制备了多种重大动物疫病的基因工程蛋白用于抗体监测的免疫学诊断试剂研发生产,目前已经取得不错的进展,快灵生物将随后提供动物重大疫病的抗体检测ELISA试剂盒及胶体金试纸产品,给广大客户一个全面的免疫检测解决方案。

防污染基因试纸卡检测盒包括基因提取、恒温扩增试剂及基因层析试纸卡三部分。其特点是快速、精确和简便,适合我国农牧业基层单位的检测条件和需求。所有试剂能常温运输;单类试剂在常温下完成 DNA/RNA样品提取,仅需微型离心机10分钟两步离心完成操作;恒温基因扩增时一步加样后密闭试管在62℃恒温金属浴上保温30-45分钟,扩增完成后将试管插入试纸卡后一步按压就完成了操作,3-5分钟能目视判定层析试纸的线条结果;专利申请中的基因试纸卡彻底解决了扩增产物形成气溶胶污染环境,导致样品间交叉污染的问题,开启了基因试纸卡步入了基层养殖场的新时代。该基因试纸卡全过程操作仅需微型离心机,恒温金属浴,两支移液枪(如下图),几乎任何病原都能在基层单位现场执行检测,一个小时可出结果。专利申请中的试纸卡能实现多个反应管套用或并用,因此能根据需要在同一个试纸卡上进行多个项目的混合联检。

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基因试纸卡是一个通用的基因检测技术平台,除了畜牧业的动物疫病检测,在人类医学,植物及微生物病原等方面同样有巨大的商业推广价值。鉴于医学领域的基因检测技术已经被荧光定量PCR垄断型占据,而基因试纸卡的最大优势在于基层单位的应用推广,同时快灵生物相关人员毕业于南京农业大学,四川农业大学等院校,因此快灵生物前期将集中在农牧业领域进行推广,希望能给中国的动物疫病防控做出微薄的贡献。

以下是该产品的简单操作流程,给大家展示了国内最简练的基因恒温扩增检测方法,这样简单的操作即使中学文化的人员都能顺利地完成。

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PCR1985年在美国诞生的第一个体外核酸扩增技术,是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。它不仅可以扩增和分离目的基因, 在临床诊断、基因突变检测、法医鉴定等方面也有广泛应用。但PCR方法要预先变性双链DNA、需要快速升降温PCR仪,需要进行扩增条件的设置等,基层单位一方面难以负担昂贵的PCR仪,同时也没有专业的技术人员。

近年来,为了将基因扩增技术在基层单位普及,涌现出一些新的技术,如:荧光定量PCR、恒温核酸扩增技术,但始终没有一套适合基层的最佳技术方案。基因扩增技术在基层应用的阻碍主要包括:1、流通环节,核酸试剂需要冷冻保存,成本高昂且运输半径有限;2、核酸提取环节,提取步骤复杂缓慢,依赖仪器设备,基层技术人员操作困难;3、扩增环节,基层单位无法购买昂贵的PCR扩增仪,基层技术人员不能良好掌握核酸扩增的技术和高精仪器的使用;4、核酸扩增环节,传统的凝胶电泳检测步骤复杂缓慢、灵敏度低、极易污染环境导致假阳结果,需要较昂贵的仪器和试剂耗材维持运作,且检测结果的分析对技术员的专业素质要求极高。因为这些难点的存在,在发达国家畜牧养殖和兽医诊断中普及的的核酸检测技术一直不能在我国基层单位普及,准确性不高的临床病理观察和免疫学病原检测方法在我国基层疫病检测中仍占主流,经常导致误诊、延诊,错过了最佳的治疗时间和治疗方法,给养殖户、养殖企业带来巨大损失。

近年涌现的恒温基因扩增方法与PCR方法一样对基因提取要求很高,基层单位几乎无法操作。最主要的应用障碍还是扩增产物的污染问题,疫病目的基因片段被成亿倍地大量扩增后容易形成气溶胶,后续检测的样品很容易被污染,出现假阳性现象,无法保证结果的准确性。按卫生部对PCR试剂使用的规定,检测场地要分四个独立操作区,人流物流只能单方向进入各个区域,避免发生交叉污染。空气排风的流向也要单一方向。尽管荧光定量PCRqPCR)和后续恒温扩增方法执行扩增产物不开盖的检测方式,但现有扩增反应管难免意外渗漏或开盖,因此无法避免污染的发生。鉴于严重的污染问题,国内只有省级与部分地区级动物疫控部门,以及大规模的养殖集团中心实验室才配备了PCR仪器,而且使用频率有限。

快灵生物的基因试纸卡产品提供了全套领先的解决方案,对DNARNA实现了常温下的快速简单提取,将胶体金试纸技术结合恒温基因扩增技术达到了高灵敏度的检测,专利申请中的防污染试纸卡装置彻底消除到了基因扩增产物的污染问题。一步法恒温扩增技术及该试剂产品常温运输方式的实现,开启了开启基因检测试纸卡步入养殖场的时代。

基因试纸卡是目前最适合进行动物疫病防疫的产品。目前兽医学上进行动物疫病诊断最依赖的是免疫学抗体及抗原检测试剂盒或层析试纸条。但抗体检测的结果更多反映了动物的免疫保护状况,除了个别项目如伪狂犬的gE抗体或口蹄疫的非结构蛋白抗体,其他抗体无法确定动物的感染状况。而且动物在遭受感染后,病毒要在体内潜伏一定时间,动物才会产生抗体。这段时间就是窗口期疫病抗原的免疫试剂能直接检测到抗原,能缩短窗口期。但它依赖于识别特殊抗原表位的抗体。尤其是种属特异性,亚型特异性,或毒株毒力相关表位特异的抗体,很难筛选到覆盖了合适范围的病原范围的两个抗体来匹配夹心法试剂。此外疫病抗原的免疫试剂如ELISA的细菌检测灵敏度一般在105~107/ml,相对基因检测技术的灵敏度如HIV病毒50拷贝/ml有明显的差距。很多不处在发病状况的动物有携毒甚至排毒状况,但其浓度偏低,抗原检测试剂灵敏度无法检测出。据报道,HIVqPCR可缩短窗口期至1周以内。拥有相同灵敏度的基因试纸卡产品也能提前确诊病原,很有应用价值。

基因试纸卡检测盒的好处之一在于新产品研发的快捷方便。理论上说,只要能在基因库中查询到正确的基因序列,一周时间内就能在实验室研发出任何新的检测产品。当然新产品需要通过适当地临床试验进行特异性确认。如果是对某个容易发生基因变异的病原进行种属通用型的基因检测,那需要更细致的临床复核工作。目前快灵生物开发的产品系列有猪疫病,禽疫病,人畜共患疫病,食源性致病菌,宠物疫病,水产疫病,其他类的产品还在进行基因序列的比对和引物的设计,很快可以推向市场,我们欢迎客户提出他们有需求的临床检疫项目进行定制开发。

我们充分考虑到了基层养殖户的条件和需求,提供了一套全新的基因检测解决方案,快灵生物的基因试纸卡检测盒的优势在于:

1.基因的简单快速提取:快灵生物的基因提取试剂在常温下10分钟内能完成DNARNA样品的提取。基因提取方法有许多商业产品,按原理分有三类产品:硅胶柱法、磁珠法和酚-氯仿抽提法,但这些方法有一定的使用限制,如提取时间均在30min以上且操作繁琐,硅胶柱法和磁珠法的核酸提取回收率不高。尤其是在RNA病毒的提取上,大部分产品要求在低温冷冻条件下提取操作,基层单位无法实现。目前基因变异最快,危害性最大的疫病往往都是RNA病毒。快灵生物经过无数次的实验摸索,终于配制了独特的基因提取试剂,仅需微型高速离心机10分钟两步离心就完成了基因提取 解决了RNA的基层提取简单化课题。我们已经在细菌病毒样品,全血与组织样品分别进行了DNARNA的提取实验,结果都很良好。简单的基因RNA提取试剂是基因试纸卡步入基层应用的基础。

2. 快速的高灵敏度且特异的基因检测技术:快灵生物通过胶体金试纸实现了基因扩增产物的高灵敏的特异检测。胶体金试纸已经成为人类医学免疫检测技术的三大类产品之一,在农业领域也已经广泛使用,是最适合农牧行业基层单位使用的产品。无论是医学乙肝表面抗原,还是食品安全的克伦特罗,没有任何样品前处理的情况下胶体金试纸的检测灵敏度能达到纳克级别(单位ng/ml)。而基因扩增技术的特点则是迅速从极其痕量的样品扩增复制到亿万倍浓度。这两个技术结合在一起则是完美的高灵敏技术。我公司对照试验表明,当PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上呈现微弱信号时,快灵生物的胶体金试纸100倍稀释后仍有明显信号。当LAMP恒温扩增溶液采用染料(SYBR Green I)只能检测到微弱信号时,快灵生物的胶体金试纸100倍稀释后仍有明显信号。因此基因试纸卡能实现更高灵敏度的信号检测,或者在同样的产物浓度下,能保证更好的信号判别。最有区别的一点则是染料检测方法没有特异性,只要溶液中存在一定浓度的核酸序列就有信号,却无法区分信号是来自特异扩增基因序列,还是非特异扩增产物。而基因试纸卡的检测方式则是将扩增的引物与扩增产物的探针进行联合检测,能很好地区分非特异扩增产物。

3. 革命性的防污染基因试纸卡:快灵生物专利申请中的防污染基因试纸卡,是目前解决基层单位基因扩增产物污染的最佳方案。尽管在荧光定量PCRLAMP等方法中,可以不开盖进行检测,但现有的反应试管并没有严格密封的结构设计,渗漏与意外开盖仍然可能发生。某些采用了层析试纸进行基因检测的商业产品气密性较差。层析试纸上的扩增产物形成的气溶胶在白天与晚上出现较大温差时被释放出来。快灵生物专利申请中的防污染基因试纸卡的反应管有两级密封设计,试管盖反锁倒扣住不能轻易被打开;反应管插入试纸卡中后也被两级密封沟反锁倒扣并被密封;试纸管也被两级密封沟反锁倒扣并密封。因此其内部的扩增产物将被封存在试纸卡中,彻底消除污染隐患。

4. 一步法快速的恒温基因扩增技术:快灵生物采用了独创的桥式成环滚环扩增方法(简称BRCA,专利申请中)一步法恒温基因扩增技术,是最方便简单且适合基层单位的选择。尽管近年陆续出现了多种恒温扩增技术,但很多技术还是需要在多个恒温条件进行多步操作才实现核酸(DNARNA)的扩增。快灵生物的BRCA方法能一次添加相关试剂与样品后,在62℃温度下反应30-45分钟就达到了层析试纸需要的信号浓度。这种简单方便的一步法恒温基因扩增技术,极大地减少了其他检测试剂繁杂的操作导致的结果波动,减小了由操作人员带来的误差。

5. 基因试纸卡检测试剂的常温运输:快灵生物的基因试纸卡检测盒中的试剂与物料都能在常温下运输,解决了基因检测试剂对基层单位的物流障碍。目前绝大部分的基因检测试剂都需要在-20℃的条件下采用干冰运输,使得产品的配送和使用极为不便。作为农牧业的基层单位,出于疫病防控的需要,畜禽养殖场往往地处偏远的郊区或乡村。基因检测试剂的常温运输,是基因检测技术进入这些基层单位的先决条件。快灵产品则采用独有的保护剂,对检测试剂中不易保存的成分进行冻干固化,完全实现了产品的常温运输,给广大养殖场开启了基因检测技术的大门。

6. 最快速的基因检测方案:快灵生物提供了国内最快速的基因检测技术,在45-60分钟内能完成大部分疫病的高灵敏度的定性检测。从完成临床样本的前处理开始,基因提取10分钟,DNA恒温扩增30分钟,基因试纸卡的层析信号3-5分钟就能看到检测结果,这是基因检测技术的突破。有了这个技术,几乎所有的畜禽养殖场不再需要将采集的临床病料外送进行检测。除了节约检测时间,也大大减少了临床病料在运输过程中的病毒传播扩散的风险。对很多肉类食品与药品企业来说,快灵生物的基因试纸卡能将致病性细菌及其它微生物的检测时间大大缩短,加快原料与成品的质控流程。

7. 最适应基层人员使用的方案:快灵生物的基因试纸卡检测盒的全流程操作简单方便,即使中学文化人员经简单培训就能掌握。因此对广大的基层单位客户,采用基因试纸卡进行疫病检测,完全不需要额外招聘专业的技术人员。同时基因试纸卡所需配套仪器只有微型高速离心机,恒温金属浴和两支移液枪,需要的配置费用不超过6千元,绝大部分的基层单位都能负担得起。将这些设备安装在机动车上,就能在国内的食品安全领域实现工商质检部门的致病微生物的流动基因定性检测了。

动物疫病检测,不但需要简单、快速、准确的检测结果,而且对检测成本也有着苛刻的要求,尤其是基层动物疫病检测。长期以来,受经济条件、技术发展、成本因素等各方面条件的制约,适合基层使用的疫病检测产品相对缺乏。我们这项技术,旨在为基层动物疫病检测工作提供一套全新的检测手段,以相对低廉的成本,简单的操作,获得精准的检测结果。推广这项技术,可以对疫情开展即时监测,为动物疫病的防控打好基础。正是因为拥有以上的优势,所以相信我们的基因试纸卡在畜牧业的疫病检测将有广阔的市场前景。

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