高敏PCR试剂盒(熔解确认版) ——快灵高敏试剂盒“PLUS”!
发布时间 : 2021-06-28 16:07:19自2020年10月上海快灵发布“非洲猪瘟高敏PCR试剂盒”(下称高敏试剂盒)以来,其出色的灵敏度、敏感性、特异性及稳定性迅速被广大猪场实验室认可。随着荧光PCR相关技术的普及以及用户群体的增大,部分之前未被重视的问题也逐渐显露出来。本篇我们探讨下各厂家都讳莫如深的一个点——“假阳”问题,以及相应的解决方案。
“假阳”问题,事实上在荧光PCR领域并不少见,而造成假阳产生的原因也是纷繁复杂:如操作不当污染、环境气溶胶污染或者试剂生产过程污染等。本文所要探讨的“假阳”,主要指因试剂特异性导致的假阳,换句话说,即文中所提的“假阳”,与操作者、仪器、环境均无关,只与试剂盒内的试剂有关。那么试剂盒中到底什么与“假阳”相关呢?纵观商业化的非瘟病毒PCR检测试剂盒,其中都会提及一个重要参数——特异性。
何为特异性呢?在PCR扩增过程中,如果我们要扩增的非洲猪瘟DNA片段在整条DNA链上不止出现了一次,或者样品中混有的其他物种、细胞或病毒的DNA中含有类似的DNA片段,则可能会将其他片段扩增出来,那最后仪器显示出来的阳性结果就不一定是非瘟病毒DNA造成的,于是阳性结果也就变成了假阳。因此,通俗来说,特异性反应的是试剂盒能扩增出特定DNA片段的性能,特异性越低,则试剂盒扩增其他片段的概率就越大,即“假阳”几率更大。
市售的众多非瘟病毒PCR检测试剂盒中,绝大多数厂商在宣传其试剂盒特异性时均会标注>99%,最低也不会低于98%,快灵的高敏试剂盒也是如此,特异性可达到99.9%,属实是已经做到了极限,即使PCR技术发展至今,因为模板DNA的不确定,依然无法保证100%的特异性。也正因此,特异性,也就是假阳的问题是被大家忽视了。
在服务客户的过程中,我们发现很多客户在进行非瘟病毒检测遇到极弱样本或疑似样本时,对于阳性场,往往遵循的是“宁杀错,不放过”,而对于阴性场,往往带来心理的恐慌,需要确认到底是不是阳性。的确,随着非瘟一波波的袭来,各检测单位的工作量都史无前例的倍增,再重新来一遍的全面复核,显然是对人力和成本的巨大考验。面对这样的大环境,快灵人陷入了沉思。
“我们为什么要宁杀错?”
“当真没有办法消除假阳么?”
带着这样的问题,我们开始了新的一轮又一轮的尝试:提升试剂盒的灵敏度、将特异性由99%提升至99.9%……或许,我们可以把眼界放宽,不局限于单纯的扩增?
于是,高敏试剂盒上市半年后,我们在高敏试剂盒基础之上研发出其“升级版”——快灵高敏试剂盒(熔解确认版)。
快灵高敏试剂盒(熔解确认版),其性能参数与高敏试剂盒一致,我们同样保证其灵敏度、敏感性、稳定性、特异性处在行业顶尖水平,确保客户可以第一时间检测出阳性样本。包括其操作、扩增阶段也与高敏试剂盒别无二致,至此,我们可以把快灵高敏试剂盒(熔解确认版)等同于高敏试剂盒。详见表1:
表1:高敏试剂盒与假阳确认试剂盒基本性能参数对比
性能 | 高敏试剂盒 | 高敏试剂盒(假阳确认版) |
灵敏度 | 400copies/mL | 400copies/mL |
敏感性 | ≥99.9% | ≥99.9% |
特异性 | ≥99.9% | ≥99.9% |
稳定性 | CV<3% | CV<3% |
规格 | 50T/盒 | 50T/盒 |
反应体系 | 25μL | 25μL |
反应时长 | 55min | 55min(单扩增) 70min(扩增+熔解) |
UDG酶 | 有 | 有 |
内标 | 有 | 有 |
但,重点来了!快灵是怎么做到的?快灵高敏试剂盒(熔解确认版)突破性地使用了一个新的反应程序——熔解曲线。熔解曲线能鉴别不同的DNA片段,依靠的不是Ct.值,而是其特有的熔解峰,即Tm值,即使一个DNA片段中仅相差一个碱基,都能导致Tm值变动。依靠Tm值的判定就可以确认之前扩增阳性的非瘟样本是否为真的非瘟阳性,以此达到鉴别假阳,消除客户疑虑的目的。
图1:扩增曲线Ct.值判读阴阳 图2:熔解曲线检测疑似/弱阳样本,排除假阳
非瘟新形势下,除了要求试剂盒更早的检测出阳性,更需要真正“精准”检测。快灵高敏试剂盒(熔解确认版)除了超高的灵敏度、特异性,更是“自带”熔解曲线,让假阳无处可藏,让弱阳“站得住脚”,真正做到打消客户疑虑,真正做到“不杀错、不放过”。